Estrogen Related Receptor α (ERRα): a new target linking metabolism to Adrenocortical cancer progression

Abstract

I Carcinomi surrenalici (ACC) sono tumori rari e altamente aggressivi, associati a una prognosi infausta per un alto rischio di recidiva e di opzioni terapeutiche limitate [Stojadinovic A. et al., 2002]. Ad oggi sono stati indicati diversi approcci terapeutici, ma la chirurgia rimane il trattamento di prima scelta per la rimozione del tumore primario o delle metastasi isolate [Crucitti F. et. al., 1996]. L’evidenza della presenza di recidive o metastasi in regioni distali in un terzo dei pazienti trattati chirurgicamente fa emergere la necessità di individuare una terapia adiuvante che possa eliminare questo rischio [Donatini G. et. al., 2014]. Ad oggi, il Mitotano rappresenta l’unico farmaco approvato negli USA e in Europa per il trattamento dell’ACC. La chemioterapia è riservata agli stadi avanzati della malattia, con evidenti metastasi resistenti al trattamento con mitotano. L’eziologia del cancro surrenale rimane ancora ignota, ma studi effettuati negli ultimi 10 anni suggeriscono che alcune mutazioni genetiche nella ghiandola surrenale sono alla base della genesi di un tumore maligno. Quella più diffusa interessa il locus (11p15) del fattore di crescita II insulino-simile (IGF-II). Infatti, l’IGF-II è over-espresso nel 90% degli ACCs e determina un effetto mitogenico autocrino attraverso l’attivazione delle vie di segnalazione mediate dal recettore IGF1R [Logie A. et al., 1999] quale la via Ras/MEK/ERK e Pi3K/Akt. È stata inoltre rilevata una upregulation dell’IGFIR nel 90% dei casi [Giordano T.J. et al., 2003]. Studi seguenti hanno evidenziato la presenza nell’ACC di un’overespressione del recettore estrogenico alfa (ER-α). Sirianni e collaboratori hanno meglio definito i pathways innescati in risposta all’attivazione dell’ER-α dimostrando l’esistenza di un cross-talk tra ERα ed IGFIR [Sirianni R. et al., 2012]. Inoltre, più recentemente [Casaburi I. et al., 2015] è stato osservato come nell’ACC via sia una overespressione dell’ERRα e che tale recettore è implicato nella patogenesi di questo tipo di tumore. È riportato che l’ERRα è un recettore nucleare coinvolto nel controllo di funzioni cellulari che riguardano principalmente il metabolismo energetico e la biogenesi mitocondriale [Villena J.A. et al., 2008] e che la diminuzione dell’espressione di ERRα è associata all’inibizione della crescita delle cellule tumorali [Stein R.A. et al., 2008]. Infatti, diversi studi hanno rilevato come ERRα possa rappresentare un marcatore prognostico del tumore al seno, alle ovaie, al colon e alla prostata [Kraus R.J. et al., 2002; Suzuki T. et al., 2004; Cavallini A. et al., 2005; Cheung C.P. et al., 2005]. La downregulation dell’espressione di ERRα potrebbe inibire, infatti, significativamente la crescita delle cellule tumorali [Wu Q. et al., 2013; Chang C.Y. et al., 2011], mentre la sovraespressione di ERRα è legata ad un esito clinico infausto e conferisce resistenza ai farmaci [Kraus R.J. et al., 2002; Suzuki T. et al., 2004]. Questi dati suggeriscono, quindi, che ERRα rappresenta un nuovo target molecolare per il trattamento del cancro [Stein R.A. et al., 2008]. In uno studio condotto in cellule H295R di tumore adrenocorticale [Casaburi I. et al., 2015], è stato dimostrato che la deplezione di ERRα dopo trattamento con un agonista inverso denominato XCT790, causa la riduzione della massa e della funzione mitocondriale portando all’attivazione di meccanismi che esitano nella morte delle cellule tumorali. Questi risultati confermano che ERRα svolge un ruolo importante nella regolazione della funzione mitocondriale e nella biogenesi mitocondriale nelle cellule di ACC supportando l’ipotesi che può essere considerato come un regolatore “master” della riprogrammazione metabolica nell’ACC. Recentemente è stata dimostrata una correlazione tra uso della curcumina e modulazione dell’espressione dell’ERRα. È stato evidenziato, infatti, come in cellule di osteosarcoma, la curcumina riduce l’espressione genica di ERRα attraverso l’upregolazione del microRNA miR-125. In particolare, è stato osservato come la curcumina promuove l’apoptosi attivando il signalling miR-125/ERRα [Chen P. et al., 2017]. La curcumina, il principale componente dei rizomi essiccati di Curcuma longa, è stata utilizzata come colorante alimentare per secoli nei paesi dell’Asia orientale [Malik M. et al., 2009]. Precedenti studi hanno dimostrato come la curcumina presenta una vasta gamma di attività farmacologiche tra cui quella anti-infiammatoria, anti-diabetica, cardio-protettiva e neuro-protettiva [Aggarwal B.B. et al., 2005]. Inoltre, la curcumina è in grado di promuovere la guarigione di ferite, proteggere dalle lesioni epatiche, dalla formazione di cataratta e dalla tossicità polmonare [Aggarwal B.B. & Harikumar K.B., 2009]. Nel 1995 alcuni ricercatori [Menon L.G. et al., 1995] proposero la possibilità che la curcumina avesse un effetto antitumorale. Da allora, l’attività anticancro della curcumina è stata ampiamente studiata. Prove crescenti suggeriscono che la curcumina può essere utilizzata sia per la prevenzione che per il trattamento in diversi tipi di tumori umani [Anand P. et al., 2008; Ravindran J. et al., 2009; Bar-Sela G. et al., 2010; Quan-Jun Y. et al., 2015]. Negli Stati Uniti, il National Cancer Institute ha classificato la curcumina come agente anticancerogeno e chemo-preventivo di terza generazione [Odot J. et al., 2004]. Sebbene è stato dimostrato in diversi studi come la curcumina svolga un ruolo essenziale nell’inibire la proliferazione e la metastatizzazione delle cellule tumorali [Shishodia S. et al., 2007; Troselj K.G. & Kujundzic R.N., 2014], i meccanismi molecolari alla base del suo effetto antitumorale rimangono poco conosciuti. Inoltre, sebbene la curcumina abbia numerose attività farmacologiche, il suo utilizzo come agente terapeutico non è stato ancora approvato a causa della sua bassa biodisponibilità [Anand P. et al., 2007]. Tra i fattori che contribuiscono a questo limite possono essere inclusi: bassa solubilità in acqua, scarso assorbimento, bassa distribuzione tissutale, alto tasso di metabolismo, inattività dei prodotti metabolici e/o rapida eliminazione e clearance dall’organismo [Ravindranath V. & Chandrasekhara N., 1980]. Gli effetti farmacologici ottimali richiedono una dose orale maggiore di 0,8 g/die. Pertanto, nel corso degli anni, al fine di migliorare il profilo farmacocinetico della curcumina e l’assorbimento cellulare, sono state sviluppate diverse strategie. Queste includono derivati strutturali della curcumina, preparazione di analoghi e nuovi sistemi di somministrazione di farmaci che potrebbero migliorarne la solubilità e prolungarne il tempo di permanenza nel plasma. Recentemente, diverse ricerche sono state effettuate con lo scopo di formulare “delivery systems” più efficienti come ad esempio l’incapsulazione della curcumina in nanoparticelle polimeriche o in liposomi che però non hanno ottenuto molto successo [Ji H. et al., 2016]. Recentemente è stato messo a punto un sistema alternativo ai tradizionali “delivery systems” denominato “Solid Lipid Nanoparticles” (SLN) che offre diversi vantaggi nel trasporto di farmaci poco solubili. Il sistema SLN conferisce alla molecola bioattiva maggiore stabilità e biocompatibilità e minori problemi di tossicità rispetto ad altri sistemi di trasporto. Le SLN possono essere somministrate sia per via orale che per via parenterale o transdermica. A ciò si associa il vantaggio che le metodiche di preparazione delle SLN sono semplici e di facile esecuzione e necessitano di pochi eccipienti nella formulazione [Rompicharla S.V.K. et al., 2017]. Pertanto, la preparazione di una nuova formulazione utilizzando il sistema SLN potrebbe migliorare notevolmente la stabilità, la biodisponibilità e l’efficacia antitumorale della curcumina. Alla luce di questi dati di letteratura, lo scopo di questo lavoro di tesi era di indagare il ruolo di ERRα sui cambiamenti metabolici che si verificano in diverse linee cellulari ACC. Abbiamo anche studiato se i cambiamenti cellulari indotti dalla sovraespressione o dall'esaurimento di ERRα sono in grado di supportare o modulare la progressione dell'ACCCon la proteomica e l'analizzatore Seahorse XF, che consente l'analisi in tempo reale dei flussi glicolitici e mitocondriali, abbiamo studiato e rilevato un ruolo importante di ERRα nella regolazione dei cambiamenti metabolici nelle cellule ACC. Usando cloni stabili che sovraesprimono (ERR+/+) o con un'espressione del gene ESRRA silenziata (shERR-/-) nelle cellule ACC abbiamo rilevato che la sovraespressione di ERRα conferisce alle cellule ACC una migliore forma fisica mitocondriale mentre le cellule ERR-/- hanno una ridotta basale e massimale frequenza respiratoria e una ridotta capacità di riserva. Successivamente abbiamo studiato gli effetti della ridotta espressione di ERRα sulle funzioni bioenergetiche di tre linee cellulari ACC utilizzando XCT790. I risultati del test ATP mostrano che XCT790 ha abbassato i livelli di ATP nelle cellule H295R e SW13 sensibili al mitotano, mentre era inefficace nelle cellule MUC1 resistenti al mitotano. Infatti, l'analisi del contributo energetico dei mitocondri e della glicolisi rivela un'estrema plasticità metabolica nelle cellule MUC1 e H295R rispetto alle cellule SW13, che sembrano mostrare un fenotipo glicolitico. La valutazione delle funzioni mitocondriali ha rivelato la capacità di XCT790 di influenzare negativamente la frequenza respiratoria massima in tutte e tre le linee cellulari. È noto che le alterazioni metaboliche nelle cellule tumorali non sono esclusivamente associate a fenomeni di sopravvivenza e proliferazione ma incidono anche sulla motilità cellulare. I nostri dati hanno rivelato chiaramente un'influenza diretta dell'espressione di ERRα sulla motilità delle H295R. La sovraespressione di ERRα ha aumentato significativamente la migrazione delle cellule H295R e la vimentina del marker EMT mentre la downregulation del recettore metabolico, mediante ablazione genetica o con approcci farmacologici, ha mostrato una riduzione sia della motilità cellulare che dell'espressione della vimentina. Altri dati importanti provenienti dal nostro studio sono l'impatto di ERRα sulla capacità delle cellule H295R di crescere in condizioni non aderenti come sferoidi 3D, una caratteristica dell'aggressività tumorale che caratterizza le cellule staminali tumorali (TIC). XCT790 è stato in grado di ridurre la formazione e la motilità degli sferoidi 3D non solo nelle cellule SW13 ma anche, e soprattutto, nelle cellule MUC-1 resistenti al mitotano suggerendo, ancora una volta, che il targeting di ERRα potrebbe essere una chemioterapia efficace da considerare per il trattamento del mitotano fenotipo ACC resistente. . Nuovi recenti risultati hanno riportato il colesterolo come un nuovo ligando endogeno di ERRα. I nostri esperimenti confermano il ruolo del colesterolo come attivatore di ERRα che induce la motilità cellulare nelle cellule ACC. In questa tesi ci siamo anche chiesti se, oltre al colesterolo, esistessero altre molecole naturali in grado di modulare l'espressione e l'attività di ERRα. La nostra ricerca si è concentrata su un prodotto naturale derivato dalla pianta, la curcumina. I nostri risultati hanno mostrato chiaramente che la curcumina, riducendo l'espressione di ERRα, esercitava un effetto inibitorio dipendente dal tempo e dalla dose sulla crescita delle cellule H295R inducendo l'attivazione di eventi apoptotici. Inoltre, il test per ottenere colture di sferoidi 3D ha confermato come la curcumina possa modulare la capacità delle cellule H295R di espandersi, cioè di ridurre la loro capacità di metastatizzare, un atteggiamento strettamente correlato alla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) in cui le cellule epiteliali acquisiscono le caratteristiche delle cellule mesenchimali non polarizzate e migratorie. Inoltre, in base al ruolo metabolico di ERRα, l'uso della curcumina ha indotto cambiamenti significativi nel profilo bioenergetico delle cellule H295R. In particolare, i valori OCR ed ECAR ed i parametri energetici derivati dall'analisi dei dati di Seahorse e associati alle funzioni mitocondriali e glicolitiche, sono stati tutti ridotti dalla curcumina in modo dose dipendente. È noto che la limitazione dell'uso terapeutico della curcumina è dovuta principalmente alla sua scarsa biodisponibilità. Pertanto, al fine di migliorare il profilo farmacocinetico e l'assorbimento cellulare della curcumina, abbiamo prodotto SLN di curcumina e abbiamo riscontrato un maggiore effetto inibitorio dose-dipendente sulla proliferazione delle cellule H295R rispetto alla curcumina non modificata. Il trattamento con SLNs-CUR ha una risposta dose-dipendente sulla proliferazione cellulare maggiore rispetto alla curcumina talquale, con un'elevata significatività già alla dose di 10μM alle 24h, fino ad un'inibizione >75% nelle 72h di trattamento. Le cellule sono state anche trattate con il veicolo SLN alle stesse dosi e per 72 ore, per dimostrare che non ha effetti tossici quando somministrato da solo. In conclusione, in questa tesi è stato dimostrato che ERRα è un fattore regolatore chiave che modula il profilo metabolico e di conseguenza la motilità delle cellule ACC. È stato, inoltre, dimostrato che l'inibizione di questo recettore, da parte di molecole sintetiche o naturali, può bloccare fortemente non solo la crescita delle cellule ACC resistenti al mitotano, ma anche i processi di transizione delle cellule ACC a fenotipo più aggressivo e invasivo. Per questo motivo, ERRα può essere considerato un nuovo importante target da tenere in considerazione nella progettazione di una nuova strategia terapeutica per combattere la progressione del cancro corticosurrenale.