Engineering membrane biohybrid system for hippocampal neuronal cells culture

Abstract

L’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo di un sistema bioidrido a membrana, come modello di ricostruzione in vitro di tessuti neuronali per lo studio dei meccanismi di autogenerazione su differenti substrati. Le membrane polimeriche semipermeabili, per le loro caratteristiche di separazione, immunoprotezione e di matrice artificiale possono essere adoperate per la ricostruzione dei tessuti e organi in vitro. La disponibilità di membrane in diverse configurazioni e in diverso materiale polimerico ha reso sempre più attraente e interessante il loro impiego nello sviluppo di nuovi tessuti nel settore biomedicale e diagnostico. Oggigiorno, le membrane possono essere usate per lo sviluppo di organi bioartificiali e per la ricostruzione di nuovi tessuti. Nonostante il crescente miglioramento ed i continui progressi delle tecnologie biomediche, la sostituzione di organi danneggiati da traumi e/o malattie rappresenta un problema cruciale per la moderna medicina. Le terapie attualmente in uso non solo sono estremamente costose, ma spesso non sono in grado di soddisfare pienamente gli scopi per i quali vengono applicate; il trapianto d’organi è severamente limitato dall’insufficienza dei donatori e dai problemi di compatibilità. Il superamento di queste difficoltà sembra sia possibile grazie ai continui sviluppi ottenuti in un settore di ricerca, emerso di recente nel campo delle scienze dei biomateriali, l’ingegneria tissutale o tissue engineering. In tale ambito, sono state messe a punto tecniche che permettono di coltivare in laboratorio linee cellulari e tessuti con le caratteristiche del ricevente [De Bartolo et al., 2007]. In vivo, le cellule sono supportate da una matrice extracellulare che influenza la loro morfologia, proliferazione e differenziazione nonché la loro funzione metabolica. Quando le cellule sono coltivate in vitro, un simile supporto meccanico e chimico deve essere fornito dall’ambiente di coltura, per questo motivo è molto importante conoscere le proprietà di membrana (chimico-fisiche, strutturali e di trasporto), che possono influenzare le funzioni che la membrana svolge e soprattutto la compatibilità del materiale polimerico a contatto con le cellule e i fluidi del corpo. Le cellule ed i tessuti Abstract 2 ottenuti in vitro sono poi innestati nel paziente, ripristinando le funzionalità compromesse, senza dover ricorrere al trapianto di elementi biologici prelevati da donatori estranei. I tessuti ingegnerizzati, in caso di successo, si integrano con quelli del paziente, apportando in tal modo un contributo specifico e duraturo alla cura dello stato patologico, senza richiedere debilitanti e costosi trattamenti farmacologici. In questa logica, la tecnologia è interessata allo sviluppo e alla produzione di nuovi sistemi per la coltura in vitro di cellule su larga scala, con particolare attenzione al controllo dei fenomeni e delle condizioni operative che regolano il trasporto dei nutrienti e dei prodotti di scarto del metabolismo cellulare. A tale proposito, numerosi studi sono stati condotti negli ultimi anni riguardo la possibilità di sviluppare sistemi artificiali basati sull’utilizzo di biomateriali, scaffolds e cellule, che consentano la sostituzione di tessuto nervoso danneggiato o permettano di ripristinarne l’organizzazione strutturale e anatomica e, conseguentemente, le capacità funzionali [Lee et al., 2003; Schmalenberg et al., 2005]. Tra i biomateriali impiegati nel campo della tissue engineering, le membrane polimeriche semipermeabili sembrano fornire il supporto meccanico e chimico necessario a garantire la regolazione del processo di crescita e di differenziamento delle cellule neuronali in sistemi bioibridi: le interazioni cellula-substrato inducono risposte cellulari specifiche, consentendo ai neuroni di assumere un definito orientamento nello spazio e la formazione in vitro di un ricco network di connessioni sinaptiche. Un sistema bioibrido a membrana adoperante cellule neuronali potrebbe, dunque, costituire un valido strumento nel campo dell’ingegneria tissutale, per consentire lo studio dei meccanismi molecolari alla base di malattie neurodegenerative e nello sviluppo di bio-molecole da impiegare nella terapia farmacologia, per consentire di ripristinare le funzionalità danneggiate [Simonin et al., 2006]. Lo stato dell’arte riguardante la coltura di cellule neuronali su matrici sintetiche, racchiude per la maggior parte lavori che riguardano la coltura di cellule tumorali, come linee immortalizzate. Tuttavia queste cellule hanno un metabolismo che risulta essere diverso dalle cellule primarie; di conseguenza le informazioni che si ottengono non possono essere trasportate completamente alla situazione in vivo. Sono molti i casi in cui, per l’espansione in vitro di cellule neuronali, vengono utilizzate altre cellule di sostegno (glia, astrociti), allo scopo di supportare la crescita delle cellule di interesse (cocoltura). La cocoltura risultante può avere molti vantaggi rispetto alla coltura pura, in quando le cellule neuronali, ricevono naturalmente le sostanze necessarie per la crescita dalle cellule che in condizioni naturali fungono da sostegno. Dallo studio di lavori su neuroni ippocampali, è possibile evidenziare che nella maggiorparte dei casi, sono stati valutati gli effetti del substrato sulle cellule, per pochi giorni di coltura (4-5 giorni); al contrario, è proprio dal 4° al 8° giorno di coltura che le cellule neuronali ippocampali, dopo la prima fase di adesione, iniziano a crescere aumentando i prolungamenti assonici e dendritici ed esplorando così l’ambiente circostante. L’adesione è importante nelle prime ore di coltura, perché indica la presenza di una buona superficie di attacco, cioè di una buona compatibilità del supporto, ma la differenziazione e vitalità a lungo termine può essere valutata solo allungando il periodo di osservazione della coltura oltre il 4° giorno. Durante la prima fase di crescita la cellula neuronale, essendo totipotente, riesce ad adattarsi all’ambiente circostante differenziandosi, grazie anche alla presenza di molecole importanti per la crescita nel mezzo di coltura. Solo successivamente alla formazione del network, si vengono a formare degli scambi molecolari con l’ambiente circostante, importanti per il mantenimento della vitalità e funzionalità cellulare a lungo termine. L’ippocampo è un particolare zona del cervello che ha funzione di apprendimento e di memoria, risulta essere associata alla motivazione, al controllo delle emozioni, alla memoria e, oltretutto gioca un importante ruolo nel controllo delle risposte dell'organismo allo stress. Questa caratteristica plasticità è molto interessante soprattutto in caso di patologie come l’Alzahimer o in altre malattie degenerative, oppure nel coma. Lesioni provocate all’ippocampo danno luogo a disturbi della memoria e dell’apprendimento piuttosto intensi. Sono stati testati su cavie, diversi farmaci che migliorano le funzioni cognitive in caso di danni cerebrali, ma i risultati sono modesti e a volte i farmaci risultano nocivi. Attualmente esistono evidenze sperimentali che i fattori ambientali giocano un ruolo fondamentale nel recupero delle capacità cognitive.Essendo il numero di cellule neuronali stabilito alla nascita, e non variabile in quando i neuroni non hanno capacità di dividersi e proliferare, nasce l’esigenza di studiare i meccanismi di autogenerazione dei tessuti allo scopo di superare queste patologie e disturbi post-traumatici molto diffusi nella popolazione. L’obiettivo di questo lavoro di tesi sperimentale è stato rivolto alla possibilità di realizzare sistemi bioibridi a membrana per la coltura di neuroni, isolati da una regione cerebrale coinvolta in importanti funzioni neurofisiologiche, quali l’apprendimento e la memoria: l’ippocampo. Numerosi lavori riportano l’utilizzo di tale regione cerebrale per gli studi neurobiologici e funzionali, valutando non solo stadi di sviluppo critici in vivo ed in vitro [Fukata et al., 2002], ma anche i meccanismi cellulari che sono alla base di svariate patologie neurodegenerative quali l’epilessia [Ullal et al., 2005]. Inoltre i neuroni ippocampali hanno una forma ben definita, facilmente monitorabili in vitro anche per lunghi periodi di coltura [Bunker and Goslin, 1998]. Il modello animale prescelto è stato l’ibernante facoltativo Mesocricetus auratus, ampiamente utilizzato negli studi neurodegenerativi, in quanto alcuni stadi di ibernazione ed in particolare il risveglio, rappresenta condizioni simil-ischemiche cui l’animale risponde con strategie di adattamento e plasticità sinaptica [Canonaco et al., 2005, 2008]. In tali sistemi la capacità delle membrane di fornire un adeguato microambiente alle cellule in coltura, dipende dalle proprietà morfologiche e chimico-fisiche della superficie di membrana e dalle proprietà di trasporto. In una prima fase è stata sviluppata una nuova membrana piana, preparata mediante inversione di fase, a partire da un blend polimerico di polyetheretherketone (PEEK-WC) modificato e poliuretano (PU). Questa membrana offre il vantaggio di combinare le proprietà di entrambi i polimeri (biocompatibilità, resistenza termica e meccanica ed elasticità) con l’elevata proprietà di permeabilità, selettività ed una ben definita geometria dei pori della membrana. La membrana di PEEK-WC-PU è stata usata per la coltura di neuroni ippocampali in un sistema bioibrido allo scopo di rigenerare il tessuto in vitro. Per dimostrare la validità del sistema sperimentale, sono state determinate il grado di interazione e differenziazione cellulare e l’attività metabolica (cosumo di glucosio produzione di lattato). I risultati preliminari mostrano la capacità di adattamento delle cellule neuronali ippocampali in coltura nel sistema bioibrido a membrana. Simile al comportamento delle cellule neuronali sulla polilisina, su questo tipo di membrana le cellule aderiscono e si differenziamento dando origine ad un complesso neuronal network. Come ulteriore conferma dell’avvenuto differziamento cellulare è stato utilizzato un marcatore cellulare specifico (MAP2), allo scopo di dimostrare l’inaterata struttura del citoscheletro delle cellule neuronali. I risultai di questo studio incoraggiano lo sviluppo di sistemi bioibridi a membrana per la coltura di neuroni ippocampali allo scopo di rimodellare e rigenerare in vitro tessuti in un microambiente controllato. Le proprietà morfologiche del substrato possono svolgere un ruolo importante nell’interazione cellulare e soprattutto nel caso di cellule neuronali possono guidare topograficamente lo sviluppo di processi assonici e dendritici. A tale scopo in una seconda fase, è stato studiato l’effetto delle proprietà morfologiche della superficie di membrana, sul differenziamento delle cellule neuronali. Membrane commerciali sia microporose di polietersulfone (PES) e poliestere (PE) e sia dense di fluorocarbone (FC) sono state caratterizzate allo scopo di definire le loro proprietà morfologiche (e.g., dimensione media dei pori, porosità, rugosità, distribuzione della dimensione dei pori) e le loro proprietà chimico-fisiche (e.g. bagnabilità, adsorbimento di acqua). Le membrane sono state modificate con coating di polilisina allo scopo di favorire l’adesione cellulare e di creare superfici con gli stessi gruppi funzionali interagenti con le cellule ed investigare solo l’affetto della morfologia di superficie sul differenziamento cellulare. Le membrane modificate sono state caratterizzate per valutare l’uniformità del coating, la rugosità della superficie e le proprietà di trasporto. Il coating ha modificato le proprietà chimico-fisiche in termini di bagnabilità, uniformando le differenze superficiali delle membrane native. Le membrane così modificate presentavano una rugosità si superficie compresa tra 6-200 nm. La modifica di superficie ha ridotto la permeanza idraulica delle membrane di poliestere e di polietereterchetone rispettivamente del 60% e del 25%, mentre per le membrane di polisulfone è rimasta invariata. Lo sviluppo ed il differenziamento delle cellule in coltura sono stati valutati in termini qualitativi, attraverso l’osservazione dei cambiamenti morfologici dei neuroni isolati e della formazione di un caratteristico network di prolungamenti assonici e dendritici sia sulle membrane di PEEK-WC che su membrane commerciali, quali PE, PES, FC. E’ stata valutata quindi la localizzazione e la distribuzione di marcatori strutturali come la β- tubulina, una proteina associata al citoscheletro, presente nel soma e in tutti i prolungamenti neuronali. Per favorire la visualizzazione dei prolungamenti assoni è stata scelta una proteina specifica di tale prolungamento e precisamente la Growth-Associated Protein-43 (GAP43). Il metabolismo delle cellule è stato valutato in termini di consumo di glucosio e produzione di lattato, presenti nel mezzo di coltura. Inoltre è stata valutata la secrezione di fattori neurotrofici come il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), al fine di analizzare l’attività neuronale di sintesi di specifici fattori differenziativi durante lo sviluppo in vitro. E’ stato in tal modo investigato il mantenimento a lungo termine della vitalità e della funzionalità dei neuroni per un periodo di tempo di 12 giorni di coltura. La rugosità della superficie di membrana ha influenzato notevolmente l’adesione cellulare e la formazione del network meuronale sulle membrane di FC (Ra= 6nm) e di PES (Ra = 50 nm). Le cellule formano prolungamenti assonici e dendritici che si ramificano e si connettono con i prolungamenti in un network molto complesso. Al contrario in membrane più rugose come quelle di PEEK-WC (Ra= 199,2) le cellule tendono ad aggregarsi ed a formare prolungamenti che si sviluppano nei pori della membrana. Le osservazioni microscopiche sono state confermate da analisi quantitative della lunghezza assonica e del metabolismo cellulare. Sulle membrane con rugosità compresa tra 6 nm e 50 nm i prolungamenti assonici sono significativamente più lunghi rispetto alle membrane con una rugosità maggiore. Le membrane con una rugosità compresa tra 6-50 nm favoriscono la formazione di strutture neuronali polarizzate e la produzione di neurotrofine specifiche come il BDNF, che ha un ruolo nella sopravvivenza e maturazione di specifiche popolazioni neuronali nonché nella trasmissione sinaptica. Il sistema bioibrido costituito da membrane i FC e neuroni ippocampali è stato adoperato per studiare l’azione modulatrice delle sub unità α dei recettori del acido γ-Aminobutyric type A (GABA), sull’organizzazione dei processi neuronali. A tale scopo sono stati adoperati molecole che svolgono un’azione altamente agonista sulle subunità α2 e molecole che svolgono un'azione antagonista sulle subunità α5. Queste subunità grazie alla loro localizzazione sinaptica ed extrasinaptica, sono critiche per le funzioni immunogeniche associative, da cui si evince che, l’interazione tra il sistema GABAergico e il sistema Gluergico può costituire un elemento potenziale che è cruciale per regolare lo sviluppo assonale e dendritico. Successivamente sono state sviluppate membrane a fibre cave (HFMs) di PEEK-WC e di Polyacrilonitrile (PAN) allo scopo di sviluppare un sistema tridimensionale altamente integrato. Le membrane in configurazione a fibra cava sono vantaggiose rispetto alle piane poiché offrono: i) Un’ampia superficie di adesione e di scambio di nutrienti ed un volume molto piccolo; ii) una compartimentalizzazione all’inerno e all’esterno della fibra e quindi separazione del compartimento cellulare da quello ex cellulare; iii) un’adeguata perfusione evitando fenomeni di shear stress. Le HFMs sono state preparate mediante dry-wet spinning e successivamente caratterizzate allo scopo di conoscerne le proprietà chimico fisiche e di trasporto. Le proprietà di permeabilità delle membrane sono particolarmente importanti per le fibre cave per lo scambio molecolare tra il compartimento cellulare e l’ambiente esterno. Quindi è stato determinato il cut-off delle fibre di PEEK-WC e di PAN che sono rispettivamente all’incirca di 78000 Da e 81000 Da. Le membrane modificate mediante coating con PLL sono state utilizzate nella coltura a lungo termine di neuroni ippocampali. La capacità di adesione e accrescimento delle cellule è stata valutata per 12 giorni di coltura. Sulle fibre di PEEK-WC è stata osservata la formazione di un network neuronale piuttosto complesso ed omogeneamente distribuito in tutta la superficie esterna della fibra mentre sulle membrane di PAN le cellule hanno formato in diverse zone della superficie di membrana dei distretti cellulari dai quali si sviluppano i prolungamenti neuronali. Su entrambe le fibre, le cellule sono state funzionalmente attive per 12 giorni. Le fibre di PAN hanno sviluppato un maggior consumo di glucosio e produzione di lattato rispetto alle fibre di PEEK-WC. Il costrutto tissutale sviluppato ha mantenuto la sua funzionalità per 12 giorni di coltura. Le membrane in configurazione a fibra cava hanno consentito lo sviluppo di un sistema tridimensionale che da un punto di vista microarchitettonico consente di dirigere e guidare la rigenerazione neuronale in un sistema modello in vitro. Nell’ultima fase di questo lavoro è stato sviluppato un sistema bioibrido adoperando una membrana biodegradabile di chitosano. I polimeri biodegradabili sono materiali che si decompongono ma i cui prodotti di degradazione persistono a lungo nell’organismo ospitante. Spesso questo termine include le sotto classi di materiali assorbibili, riassorbibili, bioassorbibili e biodegradabili. Molti scenari di applicazione, compresa l’ingegneria tessutale, necessitano per l’utilizzo in vivo di matrici polimeriche biodegradabili o di strutture che siano minimamente soggette a interazioni con il tessuto in via di sviluppo. Lo sviluppo di queste diverse funzioni solitamente richiede una microstruttura di sostegno porosa, con caratteristiche di porosità proprie dell’applicazione specifica. Il chitosano è un polisaccaride biosintetico che è ottenuto dalla deacilazione della chitina, che è un polisaccaride naturale prodotto da un’enorme numero di organismi viventi. Il chitosano è l’unico polimero pseudonaturale caricato positivamente e questo lo rende importante per molte applicazioni biomedicali. L’adesione e la crescita delle cellule su questa membrana è stata valutata mediante osservazione della coltura nel tempo (16g) ed analisi dell’attività metabolica (cosumo di glucosio, produzione di lattato) e di sintesi (BDNF) dei neuroni ippocampali in coltura. Le cellule neuronali ippocampali in coltura sulle membrane di chitosano aderiscono e si differenziano senza necessità di modifica della superficie di membrana attraverso l’utilizzo di biomolecole come la polilisina (PLL). La morfologia della cellula sulle membrane di chitosano del tutto simile alle cellule in coltura sul substrato di controllo (costituita da PSCD rivestito di PLL), non sono presenti differenze significative nella grandezza del soma e nella lunghezza dei neuriti. L’attività metabolica delle cellule, in termini di consumo di glucosio e produzione di lattato, viene mantenuta ad alti livelli per tutto il periodo di coltura; esse inoltre esibiscono una maggiore capacità di sintesi della neurotrofina BDNF, conseguente ad un miglior grado di connessione sinaptica tra le cellule. I risultati incoraggianti rappresentano un punto di partenza per lo sviluppo successivo di sistemi biobridi a membrane e biodegradabili in impianti tissutali e nella riparazione di tessuti. I risultati ottenuti rappresentano un primo approccio nella realizzazione di sistemi bioibridi che consentono una coltura di tipo tridimensionale e quindi paragonabile a quella in vivo. Tali sistemi, adoperanti neuroni ippocampali, possono essere utilizzati nello studio, in vitro, del comportamento morfologico e funzionale di popolazioni neuronali danneggiate in alcune delle più comuni malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer e l’epilessia [Ullal et al., 2005; Cotel et al., 2008].