Profilo tossicologico dell’Olio Essenziale di Bergamotto (Citrus Bergamia, Risso) in vitro e caratterizzazione dei meccanismi coinvolti

Abstract

L’utilizzo di prodotti contenenti estratti vegetali, compresi gli oli essenziali, è ampiamente diffuso nell’industria cosmetica, alimentare e farmaceutica; tuttavia, i meccanismi alla base dei loro effetti risultano spesso non caratterizzati. Nel presente lavoro di tesi sono stati indagati gli effetti dell’olio essenziale di bergamotto (Citrus bergamia, Risso) in colture di neuroblastoma umano, SH-SY5Y, di leucemia mieloide cronica, K-562, ed in cellule con fenotipo normale, in particolare, colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk. Lo studio è stato rivolto alla caratterizzazione della citotossicità indotta dal BEO e all’identificazione dei meccanismi implicati. I risultati ottenuti dimostrano che l’olio essenziale di bergamotto (BEO) riduce la vitalità cellulare in colture SH-SY5Y e K-562 quando impiegato a concentrazioni superiori allo 0,01%. Tale effetto risulta concentrazione- e tempo-dipendente. In tali linee cellulari, a seguito del trattamento con il BEO, alcune cellule presentano un fenotipo necrotico, altre le caratteristiche dell’apoptosi. La morte cellulare non si associa ad aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS); compatibilmente con un meccanismo di morte ROS-indipendente, l’antiossidante N-acetil-cisteina non previene gli effetti sulla vitalità cellulare indotti dal BEO. In tali condizioni sperimentali, la morte cellulare è preceduta da un rapido collasso del potenziale di membrana mitocondriale ( Ψm). Nelle cellule SH-SY5Y, oltre ad un’alterazione della morfologia mitocondriale, il BEO induce una riorganizzazione delle proteine del citoscheletro, perdita dell’integrità di membrana e riduzione del volume cellulare. Il danno cellula re interessa anche il nucleo ed una percentuale significativa di cellule presenta ipodiploidia. L’esposizione delle cellule SH-SY5Y a concentrazioni citotossiche di BEO induce attivazione della caspasi 3 e clivaggio di PARP; in particolare, il pattern di quest’ultimo, non è compatibile con la sola attivazione della caspasi 3, suggerendo l’attivazione di altre famiglie di proteasi. Tuttavia, l’inibizione farmacologica delle calpaine e delle catepsine mediante pretrattamento con MDL 28170 ed E-64d, rispettivamente, non previene la morte delle cellule SH-SY5Y indotta dal BEO, mentre una parziale protezione è conferita dall’inibitore delle caspasi, Z-VAD-fmk, che riduce in maniera significativa la percentuale di cellule apoptotiche lasciando inalterata la percentuale di cellule che vanno incontro a morte per necrosi. Concentrazioni citotossiche di BEO interferiscono anche con i meccanismi di sopravvivenza cellulare come suggerito dalla riduzione della fosforilazione della chinasi Akt. Inoltre, l’aumento dell’attività proteolitica indotta dal BEO determina degradazione di Akt e riduzione dei sui livelli intracellulari. L’esposizione al BEO di colture di fibroblasti di cute umana, Hs 605.Sk, documenta un profilo tossicologico differente rispetto a quello osservato in colture SH-SY5Y e K-562. La morte cellulare, valutata dopo 24 ore di esposizione al fitocomplesso, presenta prevalentemente le caratteristiche della necrosi; inoltre, essa si osserva solo con concentrazioni superiori allo 0,02%, indicando una minore sensibilità dei fibroblasti agli effetti citotossici del BEO rispetto alle cellule tumorali. Nel complesso, i risultati ottenuti dimostrano che il BEO riduce la vitalità di cellule in proliferazione attivando diverse vie di morte. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali i diversi costituenti del BEO interagiscono per indurre necrosi ed apoptosi potrebbe essere utilmente sfruttata in chemioterapia antitumorale dove spesso l’inefficacia dei trattamenti farmacologici è riconducibile ai difetti dell’apoptosi presenti nelle cellulari tumorali. Inoltre, considerando il diffuso impiego del BEO in aromaterapia e la carenza di studi tossicologici, i risultati ottenuti nel presente studio suggeriscono che i prodotti a base di tale olio essenziale debbano essere utilizzati con cautela e, comunque, a diluizioni appropriate, soprattutto quando impiegati mediante applicazione diretta sulla cute e per periodi prolungati