Il ruolo della Cromogranina A e dei suoi peptidi derivati, Serpinina e Catestatina, nella fisiopatologia cardiaca

Abstract

Il ruolo cardiovascolare della CgA e dei suoi peptidi bioattivi è stato ampiamente documentato. I livelli plasmatici di CgA (range fisiologico da 0.5nM a 5nM), inizialmente utilizzati nella pratica clinica come biomarker di tumori neuroendocrini (O’Connor and Bernstein, 1984; Stridsberg and Husebye, 1997), rappresentano anche un importante marker per le disfunzioni del sistema cardiocircolatorio come ad esempio l’ipertensione essenziale, le cardiomiopatie ipertrofico/dilatative e l’insufficienza cardiaca (Ceconi et al., 2002). Recentemente Jansson et al. (2009), e Rosjo et al. (2010), hanno dimostrato che i livelli di CgA nella sindrome coronarica acuta forniscono informazioni prognostiche indipendentemente dagli altri markers di rischio convenzionali. L’importanza della CgA nella biologia cardiaca è inoltre supportata dall’osservazione che la delezione del gene per la CgA nei topi provoca lo sviluppo di ipertensione, che può essere riportata a livelli fisiologici trattando gli animali con CST o reintroducendo il gene per la CgA in topi con background Chga-/- (Mahapatra et al., 2005). I livelli plasmatici di CgA aumentano in condizioni di eccessiva stimolazione del sistema simpatico, particolarmente evidente nell’insufficienza cardiaca. Ceconi et al. (2002) e Pieroni et al. (2007), hanno dimostrato che in pazienti affetti da insufficienza cardiaca le concentrazioni plasmatiche di CgA sono aumentate (10-20 nM; 500-1000ng/ml), e strettamente correlate alla severità della patologia. Al momento non sono però disponibili informazioni sugli effetti diretti della CgA intera sul cuore, e sui fattori che regolano la sua produzione e processamento a livello miocardico.Il presente lavoro ha quindi lo scopo di chiarire se, e in che misura, la CgA intera induce effetti diretti sulla performance cardiaca, e la possibilità di un processamento proteolitico intracardiaco stimolo-dipendente della proteina. Utilizzando ratti normotesi (WKY) e ipertesi (SHR), abbiamo valutato i) gli effetti miocardici e coronarici della CgA intera nel cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff; ii) il pathway trasduzionale (Akt/NOS/NO/cGMP/PKG) coinvolto nel suo meccanismo d’azione; iii) il processamento intracardiaco della CgA in seguito a stimolazione -adrenergica con ISO. Dal processamento della CgA deriva una serie di peptidi bioattivi; fra questi i peptidi N-terminali VS-1/2, (VS-1 CgA1-76; VS-2 CgA1-113), e il peptide C-terminale CST (CgA352-372), hanno effetti cardioattivi. La CST promuove l’angiogenesi (Theurl et al., 2010), abbassa la pressione sanguigna (Mahapatra et al., 2005; Fung et al., 2010; Gaede and Pilowsky, 2012), riduce la contrattilità cardiaca (Angelone et al., 2008; Mazza et al., 2008; Imbrogno et al., 2010), e incrementa la sensibilità dei barocettori (Gayen et al., 2009a; Gaede and Pilowsky, 2010). Recentemente è stato scoperto un nuovo frammento derivato dalla CgA. A livello della regione C-terminale, altamente conservata, il clivaggio proteico ad opera delle pro-ormone convertasi (PC1/2/3), genera un frammento di 2.9 kDa, la “serpinina” (Ala26Leu), il quale può subire una modificazione all’estremità N-terminale per formare un residuo di piro-glutammato (pGlu23Leu o pGlu-serpinina) (Koshimizu et al., 2011a,b). La presenza di entrambe le forme di serpinina è stata rilevata in colture di cellule di ghiandola pituitaria (AtT20). Questi peptidi sono in grado di inibire la morte cellulare indotta da stress ossidativo (Koshimizu et al., 2011a), e di promuovere la biogenesi dei granuli secretori nelle cellule endocrine regolando l’espressione di un inibitore delle proteasi, la proteasi nexina-1 (PN-1), che previene la degradazione delle proteine dei granuli nell’apparato di Golgi. È stato osservato che i peptidi della serpinina agiscono attraverso il pathway AC/cAMP/PKA (Koshimizu et al., 2011b), suggerendo che il meccanismo eccitatorio indotto dalla serpinina potrebbe controbilanciare gli effetti antiadrenergici e cardioinibitori indotti dalla CST e VS-1. Ad oggi non esistono evidenze sperimentali sul possibile ruolo cardioattivo della serpinina; pertanto nel presente lavoro di tesi è stata valutata la presenza di questo peptide e delle sue forme alternative nel cuore di ratto; è stato inoltre osservato in che modo influenzano la performance miocardica e la vasoattività coronarica. La serpinina e la pGlu-serpinina inducono un effetto positivo dose-dipendente sulla contrazione (inotropismo) del cuore di ratto isolato e perfuso secondo metodica Langendorff e sui muscoli papillari isolati, nonché sul rilassamento (lusitropismo) miocardico. Questi effetti miocardici sono stati accompagnati da una lieve, ma non significativa, vasodilatazione coronarica. Un terzo peptide, la serpinina Ala29Gly, non ha influenzato la performance cardiaca a nessuna delle concentrazioni testate. Sia la serpinina che la pGlu-serpinina sembrano agire attraverso il pathway 1-AR/AC/cAMP/PKA. Questi dati evidenziano le proprietà cardio-circolatorie della serpinina e della pGlu-serpinina, fornendo ulteriori informazioni su come i peptidi CgA derivati possano, controbilanciandosi, regolare finemente l’attività cardiaca in risposta a stimoli -adrenergici.Il quadro clinico dei pazienti affetti da cardiopatie è complicato da un’altra patologia che si accompagna spesso alle cardiopatie, la sindrome metabolica. E’ stato constatato, infatti, che circa il 30% di pazienti con cardiopatia ischemica acuta sono affetti da sindrome metabolica (ad esempio diabete, obesità). Il peptide CgA derivato prancreastatina (CgA250-301, PST) (Tatemoto et al., 1986; O’Connor et al., 2005; Gayen et al., 2009b), svolge diverse funzioni a livello metabolico, in particolare sul metabolismo del glucosio (Tatemoto et al., 1986). Tuttavia non sembra avere effetti a livello cardiovascolare. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo della PST e della CST nel regolare la secrezione di insulina mantenendo l’omeostasi fra l’effetto anti-insulina della PST, e gli effetti insulino-sensitizzante della CST. (Gayen et al., 2009b). È stata valutata la possibile azione della CST sul metabolismo lipidico che, come è ben noto, risulta alterato nei soggetti obesi. Le cellule adipose sono regolate dalle catecolamine attraverso quattro tipi di AR: 1, 2, 3 e 2 (Arner, 1999; Arner, 2005). L’attivazione dei recettori -AR, coinvolgento le proteine G stimolatorie, aumenta la produzione di cAMP; questo a sua volta attiva la PKA, la quale fosforila la lipasi ormone sensibile (HSL) causando l’idrolisi dei lipidi. Al contrario, l’attivazione dei recettori 2-AR, accoppiati a proteine G inibitorie, inducono effetti opposti sulla lipolisi (Lafontan et al., 1997; Stich et al., 1999, 2003; Lafontan and Langin, 2009). Pertanto l’azione netta delle catecolamine sulla lipolisi dipende dall’equilibrio fra recettori - e -AR (Arner, 2005). Normalmente l’azione lipolitica indotta dai recettori -AR prevale sull’azione -AR. Una continua stimolazione del sistema nervoso simpatico o un aumento delle catecolamine plasmatiche, è spesso associato alla desensitizzazione dei -AR (Mori et al., 2007). Studi in vivo hanno dimostrato che l’azione lipolitica delle catecolamine è ridotta nei soggetti obesi (Bougneres et al., 1997; Jensen, 1997). Il trattamento ripetuto con epinefrina induce soppressione della lipolisi, basale e indotta da epinefrina, sia in soggetti normopeso che obesi (Townsend et al., 1994). Anche negli studi in vitro la risposta lipolitica indotta dall’epinefrina è diminuita dal pretrattamento con la stessa molecola (Stallknecht et al., 1997). Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che l’aumentata massa adiposa dei topi iperadrenergici Chga-KO (Gayen et al., 2009a) possa rispecchiare la desensitizzazione dovuta all’aumento delle catecolamine circolanti (Mahapatra et al., 2005). I topi Chga-KO mostrano, nonostante gli elevati livelli circolanti di catecolamine e leptina, una notevole adiposità. Le catecolamine inibiscono la secrezione della leptina (Fritsche et al., 1998; Scriba et al., 2000; Couillard et al., 2002); la desensitizzazione del -AR potrebbe prevenire tale effetto, causando un aumento dei livelli di leptina e della massa adiposa, così come mostrato nei topi Chga-KO e in altri modelli sperimentali di obesità. Come osservato nei topi DIO (diet induced obesity), l’aumento di leptina circolante induce la desensitizzazione dei recettori per la leptina, possibile causa del fenotipo obeso dei topi Chga-KO. Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato che la CST possa ridurre l’obesità ripristinando la sensibilità dei recettori adrenergici e dei recettori per la leptina attraverso la normalizzazione dei livelli plasmatici di catecolamine e leptina. È stato infatti osservato che il trattamento cronico con CST induce una significativa riduzione della massa adiposa nei topi Chga-KO. Il trattamento con CST ha inoltre determinato una riduzione del peso corporeo e della massa adiposa anche nei topi DIO, senza alterare l’assunzione di cibo. Sia nei topi DIO che nei topi ob/ob, in cui l’obesità è dovuta all’incapacità di produrre leptina, la CST è in grado di incrementare gli effetti della leptina sul metabolismo e sul signaling del tessuto adiposo. Le nostre osservazioni suggeriscono che la riduzione della massa grassa dopo trattamento cronico con CST è dovuta ad un aumento della lipolisi e della mobilizzazione dei lipidi; inoltre sembra che la CST agisca attraverso i recettori 2-AR e i recettori per la leptina. In linea con tali osservazioni, la CST promuove l’ossidazione degli acidi grassi e il signaling della leptina.