Genomics based discovery and anticancer activity assessment of new thioviridamide-like molecules produced by actinobacteria

Abstract

Fin dalla scoperta della penicillina da parte di Alexander Fleming nel 1928, i prodotti naturali microbici hanno rappresentato una risorsa essenziale per lo sviluppo di nuovi agenti farmacologici. All’interno dell’immenso panorama di microorganismi che popolano gli ecosistemi terrestri e marini, i batteri appartenenti al phylum Actinobacteria rappresentano la principale fonte di molecole naturali bioattive. Il metabolismo secondario di questi mircroorganismi, infatti, è complesso e molto variabile, ed è responsabile della produzione di molecole molto diverse dal punto di vista chimico, biosintetico e dell’attività biologica. Una classe di metaboliti secondari relativamente recente ma in rapida espansione, è rappresentata dai peptidi sintetizzati a livello ribosomiale e modificati a livello post-traduzionale (RiPPs). Questi prodotti naturali peptidici sono dotati di diverse attività biologiche e un enorme potenziale farmacologico, con uno spettro di attività che include, tra le tante, quella antibatterica, antitumorale, ipolipidemizzante e immunomodulatrice. L’evidenza del potenziale biologico di queste molecole ha, pertanto, spinto l’interesse della ricerca biotecnologica e farmaceutica a concentrarsi su questa classe di metaboliti secondari. L’attenzione è rivolta, in particolare, all’identificazione di nuovi ceppi batterici produttori di RiPPs bioattivi e alla caratterizzazione dei pathway biosintetici, allo scopo di comprendere meglio gli aspetti biochimici alla base della loro biosintesi. In questo scenario si colloca la thioviridamide, RiPP biosintetizzato da Streptomyces olivoviridis NA005001 e caratterizzato da una potente attività antiproliferativa e pro-apoptotica nei confronti di diverse linee cellulari tumorali. Questo composto peptidico, unico nel suo genere, presenta un gruppo 2-idrossi-2-metil-4-oxopentanoile all’estremità N-terminale, un residuo di β-idrossi-N1,N3-dimetilistidinio (hdmHis), un residuo di S-(2-aminovinil)-cisteina (AviCys) che fa parte di un macro-ciclo e cinque gruppi tioammidici che sostituiscono i gruppi ammidici nello scheletro peptidico. Recentemente, il cluster genico responsabile della biosintesi della thioviridamide è stato identificato, dimostrando l'origine ribosomiale di questa molecola, ma i processi biosintetici alla base della sua produzione non sono ancora completamente noti. La promettente attività antitumorale della thioviridamide, così come la sua peculiare struttura chimica e l'interessante pathway biosintetico, rendono questo composto estremamente interessante agli occhi della ricerca. La prima parte di questo lavoro di tesi ha avuto l’obbiettivo di identificare, mediante un approccio genomico, nuovi prodotti naturali, analoghi della thioviridamide, biosintetizzati da Actinobacteria, e di effettuarne la caratterizzazione chimico-funzionale, allo scopo di valutarne il potenziale antitumorale. Studi bioinformatici, basati sull’utilizzo di tools per l’analisi di omologie di sequenza, hanno permesso di individuare, all’interno del vasto panorama di batteri dal genoma noto, microorganismi contenenti nel proprio genoma cluster genici simili a quello responsabile della biosintesi della thioviridamide. I cluster genici identificati in questi microorganismi sono risultati essere leggermente difformi da quello presente in S. olivoviridis, con differenze sia a livello del peptide precursore e sia a livello dei sistemi enzimatici di maturazione che lo convertono in un RiPP maturo. Tali microorganismi, pertanto, appaiono essere potenziali produttori di molecole strutturalmente analoghe alla thioviridamide, con caratteristiche chimiche e biologiche sconosciute alla comunità scientifica. Tre dei diversi ceppi batterici identificati si sono rivelati capaci di produrre, in determinate condizioni sperimentali, molecole analoghe alla thioviridamide: - Thiostreptamide S4, prodotto da Streptomyces sp. NRRL S-4 - Thiostreptamide S87, prodotto da Streptomyces sp. NRRL S-87 - Thioalbamide, prodotto da Amycolatopsis Alba DSM 44262 La correlazione tra i cluster genici e i nuovi prodotti naturali identificati è stata confermata mediante due diversi approcci biologico-molecolari: - la delezione del cluster genico nel ceppo batterico produttore, che ha portato alla generazione di mutanti incapaci di produrre i composti identificati. - l’espressione eterologa del cluster genico, che ha portato alla produzione dei composti precedentemente identificati in un microorganismo ospite, Streptomyces coelicolor M1146. I risultati ottenuti hanno permesso di stabilire che la thioviridamide non è una molecola unica nel suo genere, ma fa parte di una famiglia di composti, identificati in questo studio, a cui è stato dato il nome di thioviridamide-like molecules (TLMs). Uno scale-up dei processi fermentativi ha permesso di purificare i tre nuovi prodotti naturali in quantità sufficenti per la loro caratterizzazione chimica, effettuata mediante spettrometria di massa e di risonanza magnetica nucleare (NMR). Questo studi hanno confermato la diversità. chimica dei TLMs, dal punto di vista della sequenza aminoacidica, sebbene sono risultate essere conservate alcune caratteristiche peculiari della thioviridamide, quali la presenza di un macrociclo, una carica elettrica positiva conferita da un residuo di dimetil-istidinio e la presenza di legami tioammidici nello scheletro peptidico. Inoltre, dai risultati ottenuti è emerso che i TLMs sono caratterizzati dalla presenza all’estremità N-terminale di un gruppo piruvile o lattile, e il gruppo 2-idrossi-2-metil-4-oxopentanoile, caratterizzante l’estremità N-terminale della thioviridamide, è risultato essere un artefatto, generato da una reazione di condensazione aldolica tra il gruppo piruvile della molecola naturale e l’acetone utilizzato come solvente nel processo di purificazione. La thioalbamide, il prodotto naturale purificato in maggiore quantità, è stato quindi oggetto di indagini biologiche al fine di valutarne l’attività antiproliferativa e il potenziale antitumorale. I risultati ottenuti hanno evidenziato un’intensa attività antiproliferativa nei confronti di una vasta gamma di linee cellulari tumorali. Questi effetti sono risultati essere altamente selettivi per le cellule tumorali, in quanto il composto ha mostrato scarsa attività in un modello cellulare non tumorale. La seconda parte di questo lavoro di tesi ha avuto l’obbiettivo di investigare a fondo sui meccanismi molecolari alla base dell’attività antitumorale della thioalbamide in diversi modelli in vitro di carcinoma mammario, il tumore maggiormente diagnosticato tra le donne nel mondo. In questa parte del lavoro è stato utilizzato un approccio biochimico-metabolico, per valutare per la prima volta, gli effetti cellulari indotti dalla thioalbamide in linee cellulari tumorali che riflettono la diversità biologica dei diversi sottotipi di carcinoma mammario. Nei diversi modelli utilizzati, la molecola non ha mostrato significative differenze di attività antiproliferativa, dimostrando che il suo potenziale antitumorale è indipendente dal profilo recettoriale tumorale. In particolare, la thioalbamide ha dimostrato possedere abilità di indurre cambiamenti morfologici nelle cellule trattate, blocco del ciclo cellulare a livello del checkpoint G1/S e morte cellulare mediata da meccanismi apoptotici. L’apoptosi è stata confermata con diversi approcci sperimentali atti a monitorare diversi eventi chiave del processo di morte programmata, quali la frammentazione del DNA, la perdita del potenziale di membrana mitocondriale e l’esposizione della fosfatidilserina sul foglietto esterno della membrana cellulare. In aggiunta, gli eventi di morte cellulare sono risultati essere il frutto dell’innesco dei pathway apoptotici estrinseco ed intrinseco, mediati rispettivamente dal attivazione proteolitica delle caspasi 8 e 9. Lo studio delle alterazioni biochimiche indotte dalla thioalbamide è proseguito, facendo emergere la capacità del composto di derterminare nella cellula un aumento nella produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), che si sono rivelate il fenomeno scatenante la morte apoptotica indotta dalla thioalbamide. L’eccessivo aumento dei livelli intracellulari di ROS indotto dal trattamento, è risultato interessare particolarmente il compartimento mitocondriale della cellula. Questa evidenza è emersa dal momento che la cellula tumorale risponde allo stress ossidativo, indotto dal composto, con un aumento selettivo dell’isoforma mitocondriale della superossido dismutasi (SOD2), enzima deputato alla neutralizzazione dell’anione superossido, principale subprodotto della respirazione cellulare. Essendo i ROS generati dal metabolismo cellulare, il loro accumulo e il conseguente stress ossidativo sono spesso associati ad alterazioni dei pathway metabolici. La riprogrammazione metabolica è una delle caratteristiche del cancro, e i tumori richiedono cataboliti per produrre ATP, mantenere un equilibrio redox e generare biomassa. A seconda della disponibilità di nutrienti, alcune cellule all’interno del tumore sono prevalentemente glicolitiche, mentre altre hanno un fenotipo dipendente dalla fosforilazione ossidativa. Pertanto, in questo lavoro, è stato valutato anche il profilo energetico delle cellule trattate con thioalbamide, e i risultati ottenuti hanno evidenziato la capacità di questo prodotto naturale di inibire la glicolisi e la fosforilazione ossidativa, i due principali pathway energetici cellulari. Il metabolismo della cellula tumorale rappresenta un potenziale target per la terapia oncologica. Infatti, è noto che le cancer stem cells (CSCs), la sottopopolazione di cellule tumorali responsabile dell’insorgenza di fenomeni di recidiva e metastatizzazione, sono caratterizzate da una elevata flessibilità metabolica. La thioalbamide, spegnendo il metabolismo energetico tumorale, si è rivelata in grado di inibire la crescita e propagazione delle CSCs, riducendo l’efficienza di formazione di mammospheres (MFE). Nel complesso, questo lavoro di dottorato ha portato alla luce nuove conoscenze sui metaboliti secondari microbici, identificando nuovi membri della classe dei RiPPs che da oggi costituiscono la famiglia delle thioviridamide-like molecules (TLMs). Inoltre, per la prima volta, sono stati studiati i meccanismi molecolari indotti da questi nuovi prodotti naturali e, dai risultati ottenuti, è emerso che l’elevato potenziale antitumorale della thioalbamide è dovuto alla sua capacità di spegnere il metabolismo energetico della cellula maligna.