PELP1, EGR-1 and ERRα as potential targets for new therapies against adrenocortical carcinoma

Abstract

I Carcinomi surrenalici (ACC) sono tumori rari e altamente aggressivi, associati a una prognosi molto sfavorevole, principalmente a causa di un alto rischio di recidiva e di opzioni terapeutiche limitate (Stojadinovic et al. 2002). L'escissione chirurgica completa offre le migliori possibilità di sopravvivenza a lungo termine, ma abbastanza spesso, nonostante la resezione completa, l’incidenza della recidiva è molto frequente (Glover et al. 2013). L’eziologia del cancro surrenale rimane ancora ignota, ma studi negli ultimi 10 anni suggeriscono che alcune mutazioni genetiche nella ghiandola surrenale sono alla base dell'iniziazione di un tumore maligno (Libe et al. 2007; Soon et al. 2008; Giordano et al. 2009). Tuttavia, l'ACC è una malattia estremamente eterogenea e sta diventando chiaro che la patogenesi dell'ACC determina l’alterazione di diversi segnali cellulari e l’interazione di alcuni pathways. Tra questi, il sistema dell’IGF e le vie estrogeno-dipendenti sembrano essere implicati. L’individuazione di fattori coinvolti negli eventi regolatori di tali pathways cellulari può contribuire a chiarire i meccanismi molecolari alla base delle alterazioni ed a individuare potenziali target terapeutici. Il laboratorio di Biologia Applicata e Cellulare dell’Unical, sta lavorando da alcuni anni per chiarire il coinvolgimento dei pathway IGF dipendenti ed estrogeno dipendenti nell’insorgenza e nella progressione del carcinoma surrenalico. In questo lavoro di tesi si è voluto approfondire il ruolo di tre fattori coinvolti in questi pathways:  PELP1 (Scaffold Protein Proline-, Glutamic Acid-, and Leucine-Rich Protein 1);  EGR-1 (Early growth response gene-1);  ERRα (Estrogen Related Receptor α). PELP1 agisce come un coattivatore del recettore dell'estrogeno (ER) e quindi esercita un ruolo essenziale nella modulazione delle funzioni di ER. I coregolatori di ER hanno un ruolo fondamentale nella progressione e nella risposta al trattamento ormonale dei tumori estrogeno-dipendenti. In precedenza il laboratorio di Biologia Applicata e Cellulare dell’Unical ha dimostrato che, nel carcinoma adrenocorticale (ACC), ER è upregolato e l'estradiolo attiva le vie di segnalazione IGF-II/IGF1R definendo il ruolo di questo cross-talk funzionale nella proliferazione delle cellule di ACC, H295R. Lo scopo della prima parte di questo studio è stato determinare se PELP1 è espresso nell’ACC e se possa giocare un ruolo nel promuovere l'interazione tra ER e IGF1R che consente l'attivazione di vie importanti per la crescita delle cellule di ACC. L'espressione di PELP1 è stata rilevata tramite analisi Western blot nei tessuti di ACC e nelle cellule H295R. La riduzione della proliferazione cellulare delle H295R è stata valutata mediante il saggio A3-(4,5-Dimetilthiaoly)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) e mediante l’incorporazione della timidina [3H]. PELP1 è espresso nei tessuti di ACC e nelle cellule H295R. Inoltre, il trattamento delle H295R con E2 o IGF-II ha indotto la una formazione di un complesso multiproteico costituito da PELP1, IGF1R, ER e Src, coinvolto nell'attivazione rapida di ERK1/2. Il silenziamento di PELP1 spegne tale via di segnalazione e riduce la crescita delle cellule H295R indotta da E2 e da IGF-II. L’identificazione del complesso PELP1/ER/IGF1R/c-Src come parte della via di segnalazione E2- e IGF-II-dipendente nell’ACC suggerisce che PELP1 è un nuovo ed efficiente potenziale bersaglio, per ridurre la crescita dell'ACC. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi abbiamo focalizzato la nostra attenzione sul recettore EGR-1, perché in uno studio precedente si è dimostrato che il trattamento della linea cellulare di carcinoma adrenocorticale, H295R con G-1, l’agonista non steroideo, ad alta affinità per GPER (G protein-coupled estrogen receptor 1) ha ridotto la crescita tumorale in vitro ed in vivo attraverso un meccanismo GPER-indipendente. Inoltre, abbiamo osservato che il trattamento con G-1 induce arresto del ciclo cellulare ed apoptosi a seguito di un'attivazione sostenuta di ERK1/2. A partire dai nostri risultati pubblicati, abbiamo eseguito uno studio di microarray che ha chiaramente evidenziato una forte e significativa up-regolazione del gene EGR-1 nelle cellule H295R trattate per 24 ore con la concentrazione 1 micromolare di G-1. I risultati di microarray sono stati confermati dalla RT-PCR e dall’analisi Western-blot, nonché dall’ immunofluorescenza che ha rivelato una significativa colorazione nucleare per EGR-1 dopo il trattamento con G-1. EGR-1 è un punto di convergenza di molte cascate di segnali intracellulari che controllano la crescita e la proliferazione delle cellule tumorali così come altri segnali che riguardano il meccanismo di morte cellulare. Abbiamo rilevato che l'aumento dell'espressione di Egr-1 era una conseguenza dell'attivazione di ERK, ROS-dipendente mediata da G-1, prontamente invertita dalla presenza dell'antiossidante n-acetil-cisteina. Infine, abbiamo osservato che il silenziamento dell'espressione del gene EGR-1 ha invertito gli effetti principali indotti da G-1 nelle cellule di ACC, inclusa la upregolazione del regolatore negativo del ciclo cellulare, p21Waf1/Cip1 e del regolatore positivo della via apoptotica mitocondriale, BAX, così come l'inibizione della crescita cellulare. L’identificazione della via di segnalazione ROS/MAPK/Egr-1/BAX come potenziale effetto off-target del G-1 potrebbe essere utile nell'implementazione dell'approccio farmacologico per la terapia dell’ACC. Nell’ultima parte di questo lavoro di tesi abbiamo concentrato la nostra attenzione sul ruolo dell’ERRα, un target a valle di diversi pathways molecolari coinvolti nella patogenesi dell’ACC, la cui attività può essere modulata da diversi co-regolatori, tra cui il colesterolo. In un recente studio del laboratorio del Prof. Pezzi stati testati gli effetti dell'agonista inverso ERRα, XCT790, sulle H295R. Il trattamento con XCT790 (1-5-10 μM) ha diminuito i livelli della proteina ERRα in modo dose-dipendente causando anche un'inibizione dose-dipendente della crescita cellulare dopo 48-72 ore di trattamento. E’ stato inoltre studiato l’effetto in vivo dell’XCT790 su xenotrapianti di H295R. Topi trattati con XCT790 (2,5 mg / Kg) presentavano una significativa riduzione della crescita del tumore rispetto al gruppo di controllo trattato col veicolo. Inoltre, un aumento dei livelli di colesterolo nel siero è stato riscontrato in uno studio condotto su 152 pazienti con ACC. La maggior parte di questi pazienti sono stati trattati con mitotano, noto per indurre epatotossicità e disregolazione del metabolismo dei lipidi, eventi che potrebbero determinare l'aumento di Chol. Inoltre, i nostri dati sul siero di 28 pazienti con ACC trattati con il mitotano mostrano livelli di Chol superiori ai normali valori fisiologici (248 ± 11 mg / dl, media ± se). L'analisi di questi campioni ha mostrato che i livelli di Chol totali in terapia erano significativamente superiori a quelli prima della terapia (da 167 ± 21 a 229 ± 25 mg / dl). l nostri dati in vitro mostrano che la sovraespressione di ERRα in un modello di cellule tumorali corticosurrenali (H295RERRα) è in grado di aumentare la proliferazione cellulare solo quando il siero conteneva lipoproteine. Questi dati suggerisco che ERRα richiede Chol come un agonista funzionale nelle cellule di ACC. Basandoci su questi dati, abbiasmo ipotizzato che il trattamento a lungo termine con mitotano, aumentando i livelli di Chol, favorisca l'attivazione di ERRα selezionando un fenotipo di ACC più invasivo e metastatico. Questi dati combinati con i nostri risultati suggeriscono che il complesso Chol/ERRα/PCG1α è un target idoneo a controllare la crescita dell'ACC. Noi ipotizziamo che l’ERRα potrebbe essere un "regolatore principale" di riprogrammazione del metabolismo nell’ACC. In effetti, la deplezione di ERRα nelle cellule H295R ha causato una riduzione della massa e della funzione mitocondriale. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che la sovraespressione di ERRα aumenta drasticamente l'assorbimento di glucosio nelle cellule H295R, supportando l'ipotesi che ERRα sia coinvolto nell'adattamento metabolico dell'ACC. Inoltre il trattamento delle cellule H295R con XCT790 per 24 ore (un tempo inferiore a quello richiesto per causare la morte cellulare), riduce significativamente la migrazione cellulare, al contrario, la sovraespressione di ERRα aumenta questo processo. Di conseguenza, l'espressione ectopica di ERRα aumenta i livelli dei marker dell’EMT (N-Cadherin, Vimentin, Slug), mentre l’XCT790 blocca la loro up-regulazione. Un'altra osservazione interessante è l'aumento delle cellule anoikis-resisistenti in presenza della sovraespressione di ERRα. Inoltre la sovraespressione di ERRα nelle H295R aumenta la crescita in condizioni di aderenza indipendente, consente la formazione e aumenta il numero di sferoidi 3D (H295RSph). Abbiamo sviluppato H295R come sferoidi per 5 giorni, dissociati e riseminati settimanalmente nel mezzo per gli sferoidi per 5 settimane (H295RSph-5), prima di testare le cellule per la motilità. La migrazione di queste cellule era superiore alle cellule aderenti. Le H295RSph-5 hanno una maggiore espressione di marcatori mesenchimali come Vimentin, N-cadherin e Slug se confrontati con le H295R coltivate in adesione. Abbiamo valutato gli effetti metabolici indotti dal trattamento con l’agonista inverso del recettore ERRα, XCT790, sulle cellule H295R, tramite l’analisi del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Abbiamo dimostrato che il trattamento con XCT790 influenza profondamente il metabolismo ossidativo e glicolitico delle cellule H295R, infatti è in grado di ridurre il consumo di ossigeno, la capacità glicolitica e la riserva glicolitica, in maniera dosedipendente. Similmente agli effetti metabolici indotti dall’XCT790, abbiamo osservato che anche le cellule H295R trattate con Simvastatina presentato una funzione mitocondriale ridotta come dimostrato dalla diminuzione dei valori OCR ed ECAR. In conclusione, nel nostro studio abbiamo valutato gli effetti del trattamento con l'agonista inverso di ERRα e del silenziamento stabile di ERRα in un modello sperimentale di carcinoma adrenocorticale. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che ERRα svolge un ruolo fondamentale nella transizione epitelialemesenchimale e nella resistenza all’anoikis nelle cellule tumorali di ACC. I risultati ottenuti hanno confermato, nel nostro modello sperimentale, il ruolo funzionale di ERRα nell'attività mitocondriale e nel metabolismo ossidativo e glicolitico cellulare, suggerendo che ERRα svolge un ruolo fondamentale nella riprogrammazione metabolica delle cellule tumorali di ACC proponendolo come potenziale bersaglio terapeutico del carcinoma adrenocorticale. Il lavoro è stato oggetto di due pubblicazioni scientifiche: 1. CASABURI, IVAN*, AVENA, PAOLA*, DE LUCA, ARIANNA*, SIRIANNI, ROSA, RAGO, VITTORIA, CHIMENTO, ADELE, TROTTA, FRANCESCA, CAMPANA, CARMELA, RAINEY, WILLIAM E., PEZZI, VINCENZO (2017). GPER-independent inhibition of adrenocortical cancer growth by G-1 involves ROS/Egr-1/BAX pathway. ONCOTARGET, vol. 8, p. 115609-115619, ISSN: 1949-2553, doi: 10.18632/oncotarget.23314 *These authors contributed equally to this work. 2. DE LUCA ARIANNA, AVENA PAOLA, SIRIANNI ROSA, CHIMENTO ADELE, FALLO FRANCESCO, PILON CATIA, CASABURI IVAN, PEZZI VINCENZO. (2017). Role of Scaffold Protein Proline-, Glutamic Acid-, and Leucine-Rich Protein 1 (PELP1) in the Modulation of Adrenocortical Cancer Cell Growth. CELLS, vol. 6, ISSN: 2073-4409, doi: 10.3390/cells6040042 Inoltre, questo lavoro ha contribuito alla realizzazione di due REVIEWS: 1. CASABURI IVAN, CHIMENTO ADELE, DE LUCA ARIANNA, NOCITO MARTA, SCULCO SARA, AVENA PAOLA, TROTTA FRANCESCA, RAGO VITTORIA, SIRIANNI ROSA, PEZZI VINCNZO. (2018). Cholesterol as an Endogenous ERRα Agonist: A New Perspective to Cancer Treatment. Front Endocrinol (Lausanne). Sep 11;9:525. doi: 10.3389/fendo.2018.00525. eCollection 2018. Review. 2. CHIMENTO ADELE, CASABURI IVAN, AVENA PAOLA, TROTTA FRANCESCA, DE LUCA ARIANNA, RAGO VITTORIA, PEZZI VINCENZO, SIRIANNI ROSA. (2018). Cholesterol and Its Metabolites in Tumor Growth: Therapeutic Potential of Statins in Cancer Treatment. Front Endocrinol (Lausanne). 2019 Jan 21;9:807. doi: 10.3389/fendo.2018.00807. eCollection 2018. Review.