Cryobiophysics: librational dynamics and solvent accessibility in the low-temperature phases of supramolecular aggregatesDocumenti elettronici

Abstract

Studi biofisici realizzati a temperature criogeniche permettono di investigare proprietà dinamiche, cinetiche e strutturali di biosistemi che, sebbene presenti, sarebbero di difficile risoluzione a temperature più alte. Queste proprietà hanno rilevanza in molti processi fisiologici che influenzano la funzionalità biologica di macromolecole. I metodi di spettroscopia di risonanza paramagnetica di spin (EPR) sia in onda continua (cw-EPR) che in regime pulsato (FT-EPR) sono particolarmente efficienti per la caratterizzazione di aggregati sopramolecolari nello stato congelato. In questo lavoro sono presentati e discussi esperimenti di cw- e FT-EPR a 9 GHz condotti su diversi biosistemi spin-labellati (membrane lipidiche a doppio strato, fasi lamellari interdigitate, micelle, membrane naturali e proteine) nelle fasi a bassa temperatura. È dato particolare risalto allo studio delle proprietà dell’acqua di idratazione entro una distanza di 0.5 nm dai radicali nitrossidi, alla caratterizzazione della dinamica a bassa temperatura dei biosistemi e come le condizioni di idratazione influenzino le proprietà dei biosistemi a bassa temperatura. Sono anche inclusi i risultati ottenuti dall’analisi di dati di scattering di neutroni per investigare la dinamica dell’acqua di idratazione nella proteina tau umana, una proteina intrinsecamente disordinata coinvolta nell’insorgere di patologie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer. Esperimenti a tre impulsi di modulazione dell’eco di spin elettronico dall’interazione iperfine con deuterio (D2O-ESEEM) ed esperimenti di cw-EPR sono stati combinati a T = 77 K per caratterizzare il grado di permeazione dell’acqua e la polarità dell’ambiente, rispettivamente, nella shell di idratazione più prossima di aggregati lipidici spin-labellati selettivamente. È stato studiato il comportamento di fase liotropico di miscele a completa idratazione di lipidi formanti doppi strati (bilayers) di dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con lipidi formanti micelle di dipalmi-toilfosfatidiletanolamina (DPPE) derivati sulla testa polare con poli-etilene glicole di peso molecolare 2000 Da (PEG:2000-DPPE) o di Liso-palmitoilfosfatidilcolina (Lyso-PPC), studiando l’intero range di composizione (concentrazioni tra 0 e 100 mol%). Sono stati delineati i profili transmembranali di accessibilità del solvente e di polarità in liposomi stabilizzati stericamente (SSL), formati da miscele di DPPC e 2 mol% di PEG:2000-DPPE, e in micelle di polimero-lipidi. Questi profili sono stati confrontati con quelli registrati per lipidi organizzati in bilayer e in lamelle con catene interdigitate e per micelle di lipidi a singola catena. Inoltre, misure di D2O-ESEEM e cw-EPR condotte su steroidi cardiotonici spin-labellati nella pompa sodio-potassio Na+,K+-ATPase hanno mostrato che il vestibolo che conduce ai siti di legame di steroidi e cationi è relativamente ampio e ricco di acqua. Sono stati, poi, combinati spettri cw-EPR e spettri rilevati tramite echo in esperimenti a due impulsi (spettri ED) per caratterizzare la dinamica di campioni spin-labellati nello stato congelato nel range di temperatura tra 77 K e 270 K. In tutti i sistemi modello di membrana analizzati in questo lavoro, costituiti da lipidi con catene sature o insature o con catene interdigitate, si manifestano moti librazionali di piccola ampiezza angolare (< 20!) che avvengono sulla scala dei nanosecondi. Tutti i campioni studiati hanno mostrato un comportamento simile nella dipendenza in temperatura dell’ampiezza angolare librazionale, manifestando un rapido incremento in corrispondenza della transizione dinamica che avviene ad una temperatura, Td, di circa 200 - 220 K. La transizione è associata all’attivazione di moti stocastici di maggiore ampiezza che fanno sì che i bilayers superino una barriera energetica con energia di attivazione Ea ⇡ 15 - 30 kJ/mol. La prima shell di acqua di idratazione che circonda le macromolecole è fondamentale per l’attivazione della loro funzionalità biologica. È stata, pertanto, caratterizzata l’influenza dell’idratazione sulla dinamica nello stato congelato di due proteine con diversa struttura secondaria, cioè ↵ per l’albumina del siero umano e " per la "-lattoglobulina, e del più comune sistema modello di membrana lipidica costituito da DPPC. Mentre la dinamica delle proteine è inibita nello stato liofilizzato per attivarsi progressivamente in presenza di molecole di acqua, nel caso della membrana lipidica le librazioni di ampiezza significativa si registrano nella regione idrofobica interna del bilayer anche in assenza di acqua. Infine, è presentato uno studio della dinamica traslazionale e rotazionale dell’acqua di idratazione della proteina tau perdeuterata attraverso l’analisi di dati di scattering di neutroni quasi-elastico, raccolti allo spettrometro TOFTOF alla sorgente di neutroni Heinz Maier-Leibnitz. Biophysical studies at cryogenic temperatures allow us to unravel dynamic, kinetic, and structural features of biosystems that are present also at higher temperatures but difficult to resolve explicitly. These properties impact on functionally important processes of physiological relevance in biological media. Methods of electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, both in continuous wave (cw-EPR) and in pulsed, Fourier transform version (FT-EPR), are appropriate to characterize supramolecular aggregates in the frozen state. In this work, results from 9 GHz cw- and FT-EPR investigations on differing spin-labelled biosystems (such as lipid bilayers, interdigitated lamellae, micelles, natural membranes and proteins) in the low-temperature phases are presented and discussed. Emphasis is given to investigate the properties of hydration water within 0.5 nm from the spin-label nitroxide moieties, to characterize the low-temperature dynamics of the different biosamples, and to highlight the influence of hydration conditions on the low-temperature properties of the biosystems. Analysis of neutron scattering data on the intrinsically disordered human tau-protein to investigate the hydration water motion is also included. Three-pulse electron spin echo envelope modulation from 2H-hyperfine interaction with deuterium (D2O-ESEEM) and cw-EPR are jointly employed at 77 K to detect the extent of solvent permeation and the environmental polarity, respectively, in the nearest hydration shell of site-specifically spin-labelled self-assembled lipid aggregates. The lyotropic phase behaviors of fully hydrated mixtures of the bilayer forming lipid dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) with either the micelle-forming lipid poly(ethylene glycol:2000)-phosphatidylethanolamine (PEG:2000-DPPE) or Lyso- palmitoylphosphatidylcholine (Lyso-PPC) are investigated over the entire composition range (0 – 100 mol%). The transmembrane water accessibility and polarity profiles of sterically stabilized liposomes (SSL), formed by admixture of DPPC and 2 mol% of PEG:2000-DPPE, and of polymer-lipid micelles have been delineated. They are compared to those of lipid bilayers and lamellae with interdigitated chains and those of small, single-chain micelles. Additionally, D2O-ESEEM and cw-EPR measurements of spin-labelled cardiotonic steroids in Na+,K+-ATPase revealed that the vestibule leading to steroid-binding and cation binding sites is relatively wide and water-filled. Cw-EPR and two-pulse echo detected ED-spectra are used to characterize the dynamics of spin-labeled samples in the frozen state over the temperature range 77 – 270 K. Rapid librations (in the nanosecond timescale) of small angular amplitude (< 20!) manifest themselves in all the model membranes of saturated or unsaturated lipids or with interdigitated chains studied in this work. A feature shared by the investigated samples is that the temperature dependences of the segmental librational amplitudes show a rapid increase at the dynamical transition occurring at Td ⇡ 200 - 220 K. The transition is associated with the onset of stochastic motions with the bilayers crossing low-energy barriers of activation energy Ea ⇡ 15 - 30 kJ/mol. The hydration water surrounding macromolecules is fundamental in the activation of their biological functionality. The effects of hydration on the dynamics of proteins of different structures, namely ↵ for Human Serum Albumin and " for "-Lactoglobulin, and model membranes of the most common lipid DPPC in cell membrane in the low-temperature phases have been also addressed. While the protein dynamics is suppressed in the lyophilized state and is progressively activated in the presence of water molecules, it is found that segmental librations of considerable amplitudes are detected in the inner membrane hydrocarbon region even in the dry state. Finally, results on the analysis of quasi-elastic neutron scattering data collected at the Time-Of-Flight spectrometer TOFTOF of the research neutron source Heinz Maier-Leibnitz on perdeuterated human tau protein are presented, in order to describe the translational and rotational dynamics of hydration water molecules.